qPCR實(shí)驗(yàn)的成功與否，關(guān)鍵在于各組數(shù)據(jù)是否達(dá)到判定標(biāo)準(zhǔn)以及是否符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，小小的qPCR實(shí)驗(yàn)它可以變得很簡(jiǎn)單，也可以變得很復(fù)雜，如何抓住qPCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵，是分析qPCR結(jié)果可信度的第一步。

qPCR數(shù)據(jù)分析主要是利用Cq值進(jìn)行計(jì)算，所以我們需要了解qPCR反應(yīng)中幾個(gè)重要的參數(shù)，根據(jù)參數(shù)的表現(xiàn)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估：

擴(kuò)增曲線：圖1反映的是熒光信號(hào)變化量的對(duì)數(shù)與qPCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系。圖2反映的是隨著qPCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號(hào)的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短。標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)出“S”型，具有特征性的形狀：首先背景信號(hào)，然后是三個(gè)增長(zhǎng)階段（指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期）。

圖1：擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜。

圖2：擴(kuò)增曲線線性圖譜。

基線：通常3-15個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)變化不大，變化趨勢(shì)接近于一條直線，即擴(kuò)增曲線的水平部分，這樣的直線就是基線。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線。

閾值：是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過(guò)閾值與X軸平行的直線稱(chēng)為閾值線，自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動(dòng)設(shè)置是置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Cq值：qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時(shí)一般取Cq:15-35，太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

圖3：擴(kuò)增曲線。

1、擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)

為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，并至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。擴(kuò)增效率E在90-110%之間時(shí)，認(rèn)為擴(kuò)增接近理想情況。

R2值：評(píng)估PCR效率的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它是說(shuō)明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果R2等于1，則可以用Y值（Cq）來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值（初始模板量）。反之，如果R2等于0，就不能通過(guò)Y值來(lái)預(yù)測(cè)X值。一般認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值大于0.98時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

圖4：標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、重復(fù)性

重復(fù)性即是指精確度，反映多次測(cè)量值之間的接近程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計(jì)量方法。如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就??；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。

例如，假設(shè)PCR反應(yīng)效率是100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Cq間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Cq值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于0.250。總的來(lái)說(shuō)，重復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

圖5：8個(gè)重復(fù)孔的擴(kuò)增曲線。

3、重現(xiàn)性

指不同批次之間或不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR結(jié)果的變化，通常表示為拷貝數(shù)或Cq值的SD或CV。

圖6：4臺(tái)獨(dú)立的儀器上檢測(cè)GAPDH，Cq =20.11，SD= 0.002。

4、靈敏度

分析靈敏度是指一個(gè)樣本中可通過(guò)實(shí)驗(yàn)精確測(cè)量的最小拷貝數(shù)，而臨床靈敏度是指在特定疾病患者們中，被檢測(cè)確定為陽(yáng)性的百分比。靈敏度為limit of detection（LOD），即在給定的分析程序中，可以確定且合理（通常使用95%的概率）檢測(cè)得到的濃度，可通過(guò)梯度稀釋樣品來(lái)確定最低檢測(cè)限。LOD理論上最小是3 copy/aliquot，這是由遵從泊松分布的取樣誤差導(dǎo)致的。假設(shè)符合泊松分布，那PCR有95%的可能性至少包含和檢測(cè)到1個(gè)拷貝。

圖7：5個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)。

5、準(zhǔn)確度

反映測(cè)量值和真實(shí)值的接近程度，以倍數(shù)變化或拷貝數(shù)進(jìn)行估算。

6、特異性

指qPCR實(shí)驗(yàn)中只可以檢測(cè)到目的基因，引物特異性擴(kuò)增靶序列，而不會(huì)擴(kuò)增其他基因序列。可通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一條帶，或通過(guò)qPCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線是否具有單峰來(lái)判斷。

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